让细胞，慢——冻—速融！

一般来讲，细胞转移最有效的方法是进行低温保存（- 70℃～- 196℃），而细胞超低温保存的基本原理是：当细胞处于- 70℃ 以下环境时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过 0～- 20℃ 阶段的程序降温，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

经过研究人员的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻速融，这样可以最大限度的保存细胞活力。

材料准备

1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、- 20℃、- 70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。

3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。

4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5、PBS, 胎牛血清，DMSO，培养液，双抗，胰蛋白酶（0.25%）。

细胞冻存

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。

1、10% 的 DMSO+ 90% 胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15 ml 离心管中。

3、离心 1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5x10^6 /ml～1x10^7 /ml。

5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

6、冻存：标准的冻存程序为降温速率- 1～- 2℃/min；当温度达到- 25℃ 以下时，可增至- 5℃～- 10℃/min；到- 100℃ 时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入- 20℃ 冰箱 2 h，然后放入- 70℃ 冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37℃ 温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2、从 37℃ 水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上培养液，混匀。

3、离心，1000 rpm，5 min。

4、弃去上层清液，加入含 10% 胎牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃ 培养箱静置培养。

5、次日更换一次培养液，继续培养。

注意要点

1、冷冻越慢越好，复苏越快越好。

2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且 DMSO 为有毒致癌品，接触时带好手套。

3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到 5x10^6 /ml。浓度视情况而定。

4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。

5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。

6、DMSO 对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去 DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去 DMSO。部分对 DMSO 敏感的细胞需要除去 DMSO。

7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。