解决方案 | 环介导等温扩增（LAMP）原理浅析

                    解决方案 | 环介导等温扩增（LAMP）原理浅析

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年由T.  Notomi等人研发出来的一种等温核酸扩增技术。它的特点是能够在恒温条件下完成对DNA片段的扩增，从而实现基因检测的目的。这篇文章通过卡通的表现方式来解析LAMP的扩增原理。


01 DNA及其扩增的几个基本规则
  1.DNA双链的互补性与方向性： 自然界的大多数DNA都以双链形式存在：正负配对，就像一对磁铁。而且正负链的方向相反，一个从左往右，一个从右往左。DNA链的序列称为一级结构，正负链之间会形成很多氢键（虚线）来稳定结构，形成“二级结构”。而图2中的DNA单链自身就会通过序列互补形成“哑铃”型的二级结构。

                     图1：DNA双链和正负链通过氢键（虚线）结合，1234都是链中任意的序列
 

                                                图2：DNA一级序列通过互补配对形成二级结构
  2.DNA扩增需要“引物”，且只能延一个方向扩增： 引物是人工合成的可以和长DNA链互补的短序列，目的是实现DNA的扩增。DNA扩增的这种特性主要由DNA聚合酶决定。DNA聚合酶——无论是PCR中的Taq酶，还是LAMP中的Bst酶，都需要识别引物来开始序列扩增。引物的末端有暴露的-OH羟基，是DNA聚合酶的结合位点之一。聚合酶会在引物后端按照模板互补扩增，直至无链可扩。为了方便起见，本文中所有结合了DNA聚合酶并且可以扩增的唯yi方向都用红色箭头表示，且当扩增结束时，红色箭头会变为普通的末端，不能继续延伸。

                                            图3 引物、DNA聚合酶和扩增方向（√符号示意）
  3.Bst DNA聚合酶的“链置换活性”： 氢键是一种可强可弱的相互作用力，在高温时会断开，降温时会稳定，而LAMP的反应温度则处于两者之间（65℃），因此LAMP反应中的氢键理论上处于一种动态平衡的状态。LAMP中使用的Bst DNA聚合酶具有很强的“链置换活性”，两条链之间氢键可能会在断开后立马和其它链形成新的氢键（图4）


                                                                  图4 Bst聚合酶的链置换活性


02“哑铃型”核酸结构开始的LAMP扩增
 

2.1临床检查

现在我们就可以来看看LAMP是如何通过巧妙的设计来完成等温扩增。与大多数叙述LAMP的文章不同，本文直接从LAMP扩增最关键的“哑铃型”核酸入手，将它作为起点，来分解LAMP的扩增原理。笔者自制了反应过程中的中间结构（.5与.75结构）以帮助理解。

这个“哑铃型”核酸就是刚才见过的自带双环结构的DNA，它的两端可以自身配对，这种结构恰恰就自带引物结构，提供扩增的起始位点（图5）。


                                                图5 哑铃型核酸以自身为模板的扩增（1）→（2）



LAMP中并不是没有引物，但它的引物有双重作用，其中之一就是与结构（2）中存在的单环结合完成扩增形成结构（3）（图6）。

                   图6 结构（2）→（3）：（2.5）随着下方链的扩增、上方的链会逐渐解离，

                                                   并在解离完成后自身形成环结构

结构（3）自身又自带引物，可以扩增为结构（4）（图7）。在结构（4）产生的同时，也会释放出一条结构（4*），它也是可以形成哑铃型结构核酸分子，从而可以同步独立完成从结构（1）~结构（4）的扩增。

                                                 图7 结构（3）→（4），并形成一个新的哑铃结构分子
 

结构（4）上的单环又可以和体系中的另一个引物结合，形成结构（5）（图8）。以此类推，之后的结构会变得较为复杂，感兴趣的朋友可以参考T. Notomi等人发表的原文献插图。相信有本文的引导，看懂他们的插图应该不成问题。

哑铃型结构的DNA每进行3次扩增就会额外形成一个新的哑铃型结构，且原结构会继续延长，最后形成若干首尾相连的“菜花型”结构，并在此过程中同时产生新的可以独立扩增的额外模板，目标DNA会指数扩增到检测限。

由此可见，LAMP扩增的最终产物是一堆长短不一的混合物，这注定了LAMP只能用于检测，而不能用于基因克隆。但LAMP扩增使用到4~6个引物，大大增加了扩增的特异性。更多的应用可以在环介导等温扩增（LAMP）简介一文中阅读。

                                                                     图8 结构（4）→（5）

最后，留给大家一个思考题（看图9参考）：上面说到，图6和图8中出现的引物1和2有双重的作用，那么它们的第一个作用就是在任意DNA序列上构建出最为关键的哑铃型结构，这是怎么实现的呢？有了它，几乎任意DNA序列都可以用LAMP的方法来扩增了。

                                                  图9 任意DNA序列+引物→哑铃型结构

附：可使用到的耐思产品

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 移液枪头