细胞冻存tips，请查收！

细胞在正常的生长活动中会不断的代谢，需要有各类蛋白酶的参与，当低于-70℃时蛋白酶就会停止工作。所以在超低温的环境下，可以使细胞停止代谢活动，进入休眠状态，以便于长期储存。

实验材料

基础材料：

● 基础培养基

● 血清（常规为FBS/NBS）

● 超净工作台

● 无菌二甲基亚砜（DMSO）

● 无菌PBS磷酸盐缓冲液

● 移液枪

● 电动移液枪

 

耐思相关耗材：

●  PET/PETG方形试剂瓶[NEST]

●  15mL、50mL无菌离心管[NEST]                        

●  盒装无菌吸头[NEST]             

●  血清移液管[NEST]                                                         

●  杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST]                

●  针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]                                  

●  冻存管[NEST]              

●  自动旋盖机[NEST]

●  程序降温盒[NEST]

实验准备

●   冻存液准备：

一般的细胞：55%基础培养基+40%牛血清（FBS/NBS）+5%DMSO

重要的细胞：90%牛血清（FBS/NBS）+10%DMSO

冻存液配置完成后，15ml离心管[NEST]分装，4℃条件下储存备用。若配置量较大，可分装入50ml离心管[NEST]，-20℃条件下冷冻储存。（若牛血清内存在析出沉淀物，采用0.22μm 滤膜过滤除菌）

使用前37℃水浴加热。

 

●   待冻存细胞准备：

使细胞冻存前，选择细胞生长状态良好，且处于对数生长期的细胞，冻存前12~24h换新鲜培养基维持细胞状态。
 

实验流程

1、观察待冻存细胞密度，约为80%~90%。用移液枪吸出陈旧培养基，加入无菌PBS清洗细胞1-2次，去除培养环境中的残留培养基。

2、加入适量对应胰酶或消化液，使胰酶没过细胞，放入培养箱消化。显微镜下观察细胞状态，胞质回缩，细胞间不再连接成片，此时加入完终止液终止消化。

3、用吸头轻轻吹打细胞，形成细胞悬液，将细胞悬液1000rpm，离心3-5min。丢弃上清，加入适量预先配制好的冻存液，轻轻吹打使细胞均匀并计数。用冻存液调节的细胞密度，使之终密度为5×106/ml～1×107/ml。

4、用移液枪按照预计容量，分装入细胞冻存管[NEST]中，采用自动旋盖机[NEST]旋盖密封。

5、标准的冻存程序为降温速率况处-1℃～-2℃/ min，可将待冻存细胞按照以下步骤逐步冻存：室温→4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（过夜）→液氮长期保存。
也可将待冻存放入程序降温盒[NEST]，直接-80℃过夜，再转移至液氮保存。

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