一文解决双荧光素酶检测实验

自 1990 年萤光素酶生物传感器技术诞生以来，单萤光素酶检测系统到双萤光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。

双萤光素酶报告基因检测系统在单报告基因的基础上引入了「内参对照」报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

 

检测原理

萤火虫萤光素酶是一种胞内蛋白，大小为 61KDa。在氧气、ATP 和镁离子同时存在的条件下，催化底物萤火虫萤光素氧化，生成氧化萤光素，并发出黄绿色光，其最强发光波长为 560nm。

海肾萤光素酶也是一种胞内蛋白，大小为 36KDa。只需要氧气就可以催化腔肠素，氧化生成高能产物 coelenteramide，并发出蓝光，其最强发光波长为 465nm。

对于发光反应，全透明板会有明显的相邻孔之间的信号干扰，使测量结果产生误差。

为此常规实验操作流程中先在普通的透明细胞培养板中培养细胞，加入检测试剂待细胞裂解后把样品转移到全白检测板中进行检测，但此操作复杂且容易使样本损失。

 

如何隔绝信号的同时

减少样本损失？

选耐思全新材质白色细胞培养板！

以 96 孔白色培养板为例

质粒转染细胞

1、细胞铺板：将细胞按 70% 的汇合度接种到 96 孔板。

2、转染：16 小时后转染萤光素酶报告基因质粒和 RNA，每个样品设置 6 个复孔。

1) 配制 DNA 和转染试剂: 96 孔板转染质粒时每孔比例 Firefly：Renilla：转染试剂 = 0.1 μg：0.01 μg：0.25μL；

2) 配制 RNA 和转染试剂稀释液，RNA 的终浓度为 100nM，转染试剂每孔 0.25μL；

3) 稀释好的 DNA 和 RNA 及转染试剂，常温孵育 5 min；

4) 将稀释好的 DNA 和 RNA 分别和转染试剂混匀，常温孵育 20 min；

5) 每孔弃去 50μL 培养基，将 25μL DNA 转染混合液和 25μL RNA 转 染混合液分别添加到每孔细胞样品中；

6) 转染 6 小时后，换新鲜完全培养基。

双报告基因检测

1、质粒共转染 48 小时后，弃去培养基，用 100μL1XPBS 洗 1 遍；

2、 倾斜 96 孔板，吸干剩余的 PBS；

3、去离子水将 5XPLB 稀释成 1XPLB，使用前放到常温；

4、每孔加 50μl 稀释好的 1XPLB，摇床常温条件下摇 15 min，进行裂解；

5、加入预先混好的 LAR II，2s 后测数据；

6、每孔添加 100μL 预先混好的 Stop&Glo Reagent，静止 2s 后，测数据。

除新增的 96 孔板外，耐思 384 孔白色细胞培养板全新升级！材质大提升，我们研发出最适合的全光谱光反射率的材料，让每一个培养孔独自美丽，隔绝相邻孔的信号。

在同种光源照射下，由新材质制成白色细胞培养板，呈现出更为优越的避光性能。

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耐思，为你成为实验大神保驾护航！