“剪”得断，理不乱| CRISPR/Cas9技术简史（上）

    基因组编辑（Genome Editing）又称基因编辑，是基因工程的一种，指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术。其中，CRISPR/Cas9技术是目前基因编辑领域内应用最广的技术，该项技术一经诞生就被人们视为21世纪最为重要的生物发现之一。它稳定高效，已经被全球各地的研究人员应用在各种生物的基因修复、基因改造等技术中。

    然而，这一技术从被发现到被广泛应用还不到10年时间。

什么是CRISPR/Cas？

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 规律间隔成簇短回文重复序列)，是存在于细菌和古菌基因组内的⼀段重复序列。

Cas (CRISPR-associated, CRISPR关联）蛋⽩，由总是出现在CRISPR区域附近的CRISPR关联基因编码的蛋白。Cas9是其中一种核酸内切酶，即能从核酸的内部切开双链的酶。

    在自然界中，CRISPR/Cas系统能为细菌和古⽣菌提供对病毒和质粒的适应性免疫。现在，科学家通过对这个系统的重新设计和编程，可以精确识别并切断目标DNA，并诱导细胞进行DNA修复，最终实现基因敲除和基因修改。

细菌的CRISPR。钻石是“重复序列”，正方形是重复序列之间的“间隔成簇”，钻石与正方形有“规律”地在染色体内密集出现，而不是随机分布。
（图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》）

“发现”的历程

——  1987年，这种特殊的重复序列被⾸次描述。⽇本大阪大学的科学家⽯野良纯发现⼤肠杆菌基因组DNA上有⼀段重复结构：有⼀段29碱基的序列反复出现了5次，两两之间都被32个碱基形成的看起来杂乱⽆章的序列隔开。

——  1993，西班牙科学家Francisco Mojica在其他细菌和古菌中发现相似的重复序列，并将其命名为SRSR (Short Regularly Spaced Repeats, 短间隔重复序列)。
——  2002年，Ruud Jansen及他的同事首次在印刷品中使用CRISPR一词。他们还发现这些序列一般可以在CRISPR相关基因，即Cas基因旁边找到，而Cas基因所编码的蛋白质结构与那些能与DNA发生相互作用的酶的结构很相似。因此，他们推测Cas基因与CRISPR序列存在“功能上的关系”，但这种关系的作用还不清楚。

• 病毒DNA⽚段夹在细菌的重复结构中，就像是细菌在基因组⾥收藏了病毒不同⾓度的快照。凭什么仅靠记录⼀张病毒的快照，细菌就能够防御未来的病毒入侵呢？
• 现在我们知道，细菌在遭到病毒⼊侵后，能够把病毒基因的⼀⼩段存储到⾃⾝DNA中的CRISPR序列。当再次遇到病毒⼊侵时，细菌能够根据存写的⽚段识别病毒，将病毒的DNA切断⽽使之失效。

——  从1993年到2005年间，Mojica发现，夹在重复序列之间的间隔序列与许多噬菌体（专门⼊侵细菌的病毒）的基因组序列信息⾼度⼀致，提出了CRISPR是细菌的⼀种适应性免疫机制的假设。
——  2007年，在丹麦丹尼斯克公司（Danisco，世界知名的食品添加剂生产商）⼯作的科学家Rodolphe Barrangou及其团队证明，在嗜热链球菌（⽣产酸奶必须的⼀种益生菌）中⼈⼯添加⼀段CRISPR序列，可以帮助细菌抵挡某种对应病毒的⼊侵。这是首次通过实验证明CRISPR的功能与抵抗噬菌体感染有关。他们还发现，对于嗜热链球菌而言，Cas基因控制了间隔序列的获取与整合，而间隔序列可以特异性地靶向识别再次侵染的噬菌体基因组，因此，他们猜想Cas基因在CRISPR实现的免疫过程中起着重要作用，但其中细节尚不清楚。2008年，荷兰科学家John van der Oost的团队通过在大肠杆菌中的实验证实，小RNA分子协助了细菌抗病毒反应中的识别和摧毁过程，他们称之为CRISPR RNA (crRNA)。同时，他们还通过人为设计相应的crRNA序列使细菌获得了抵抗噬菌体的特性，这是人类首次编辑CRISPR系统。

• CRISPR的RNA分子如何在细胞内产生，并从长链RNA转化成更短的、只包含单一病毒配对RNA的片段？
• 细菌细胞把整个CRISPR序列翻译成一条长RNA链，一种酶把它切成更短的RNA链，它们长度一致，但间隔序列不同。这个过程把DNA中较长的重复序列变成了更短的RNA分子文库，每一个RNA分子都包含一段特定的噬菌体序列。

——  2008年，美国伊利诺伊州西北⼤学的科学家Luciano Marraffni和Erik Sontheime证明了CRISPR的RNA分子的作⽤对象是DNA⽽⾮RNA，它们是通过碱基配对靶向剪切入侵病毒的DNA。
——  2010年12月，加拿大拉瓦尔大学的Sylvain Moineau的研究证明了，嗜热链球菌CRISPR/Cas系统靶向锁定噬菌体DNA后，在目标DNA的精确位置，即PAM上游的3个核苷酸处产生双链断裂（double strand break, DSB）。

• 什么是PAM，PAM在CRISPR/Cas系统中起到什么作用？
• PAM（Protospacer Adjacent Motif）是入侵病毒的一部分，但不在细菌CRISPR中出现。如果目标DNA序列后面没有PAM序列，Cas9将不能对目标DNA进行干扰。PAM对靶向识别起着重要作用，它能帮助区分细菌自身和非自身DNA，从而防止细菌本身被CRISPR相关核酸酶锁定和破坏。

——  2011年3月，瑞典于默奥⼤学的法国科学家Emmanuelle Charpentier领导的实验室在发现，除了crRNA外，还存在第⼆个RNA分子，他们称之为trans-activating crRNA (tracrRNA)。在化脓链球菌中，tracrRNA对于病毒的失活是必需的。tracrRNA与crRNA形成双链体，将Cas9蛋白（当时被称为Csn1蛋白）引导⾄其靶标。
——  2011年8月，立陶宛维尔纽斯大学的科学家Virginijus Siksnys和丹麦丹尼斯克公司的科学家，在大肠杆菌中重组了嗜热链球菌的CRISPR系统，这种重建的CRISPR系统仍然可以实现对噬菌体DNA的靶向干扰。此外，他们还证明了，对于嗜热链球菌对应的CRISPR/Cas系统而言，Cas9核酸酶是是实现干扰所需要的唯/一蛋白质，这是II类CRISPR系统的显着特征（I类CRISPR/Cas系统中，RNA与多个Cas蛋白结合，形成识别和切割DNA的分子复合体；II类CRISPR/Cas系统则是由单个效应Cas蛋白来发挥功能）。

至此，细菌CRISPR/Cas9系统切割噬菌体DNA的三个核心要件：Cas9、crRNA和tracrRNA皆被发现。

 

（图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》）

——  2012年6⽉28日，美国加州⼤学伯克利分校的科学家Jennifer Doudna和瑞典于默奥⼤学的科学家Emmanuelle Charpentier领衔的研究团队合作在Science杂志发表论⽂（2012年6月8日投稿），他们通过体外试验证明，crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导Cas9在靶标DNA上引起双链断裂。团队还将系统所需的两条RNA融合改造成⼀条更加易⽤的单链向导RNA (single-guide RNA, sgRNA)，并证明了⼈⼯设计的向导RNA同样可以指导Cas9蛋⽩切割任意指定的⼀段DNA序列。

2020年10月，这两位科学家被授予2020年诺贝尔化学奖，以表彰她们对“基因剪刀”CRISPR/Cas9的贡献。
（图片来自 nobelprize.org）

 

参考文献

1.王立铭. 上帝的手术刀——基因编辑简史[M]. 浙江: 浙江人民出版社, 2017.

2.[美] 詹尼佛·A.杜德娜、[美]塞缪尔·H·斯坦伯格. 破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量[M]. 湖南: 湖南科学技术出版社, 2020.